全光式生理学

在基于光遗传学的全光式生理学实验中，试验动物的目标神经元通过视蛋白的激光触发而选择性地受到光刺激。视蛋白是细胞壁中的蛋白质，充当光敏离子通道。

通过观察来自基因编码钙指示剂 (GECI)（例如 GCaMP）的荧光强度，可以同时反映对与目标神经元相连的其他神经元的触发活动。实验是在模型实验室动物（例如啮齿动物和斑马鱼）身上进行的，这些动物的基因已经过修改，可表达视蛋白和 GECI。

在全光式生理学中，使用多光子光刺激对神经元进行光刺激，以得到单神经元的三维分辨率。

神经元网络（例如，在小鼠皮层中）是三维目标，因此刺激和 Ca2+ 成像必须通过 3D 识别执行，以实现单神经元灵敏度。双光子 Ca2+ 成像是一种成熟的监视工具，在全部三个维度上都具有较高的空间分辨率，这可以将诸如相干公司 Discovery 之类的超快激光器与快速共振扫描结合使用而实现。在全光式生理学的早期演示中，这些激光器还被用于双光子光刺激中去来刺激多达 10～20 个神经元。

现在，研究人员希望能够同时刺激数百甚至数千个选定的神经元，而这需要一种新的光学方法。

大量神经元的双光子光刺激

解决方案是使用新一代高重复频率超快掺镱放大器（如相干公司 Monaco）的高功率发出 1035 nm 的光，再结合使用一个或两个空间光调制器 （SLM）去做激发。建立该组合是为了以全息方式创建束腰模式，该束腰分布与要刺激的神经元的空间模式相对应。由于高度依赖双光子过程的峰值功率，因此仅以足够高的强度照射这些束腰处的神经元，就能够激发视蛋白表达。

新一代高重频超快掺镱放大器Monaco，是神经科学领域双光子光刺激实验的一些主要研究人员的首选。

为什么研究人员青睐Monaco?

该激光器的平均功率为 40 或 60 W。考虑到功率分布在许多神经元上，并且 SLM 的引入会降低光学系统的整体输出，因此需要这种较高的功率水平才能同时激发数百个神经元。

同样重要的是，<300 fs 的脉冲宽度可以更大限度地提高峰值功率与平均功率之比。这提高了双光子光刺激的效率，同时尽可能降低光损坏风险 — 双光子光刺激效率与峰值功率 x 平均功率保持一定的比例。 

短脉冲持续时间与出色的时间带宽乘积相结合，可确保激光带宽足够窄，以更大程度地减少来自 SLM 所有区域的聚焦光束的色像模糊。

激光器的全光纤架构使重复频率相当灵活，实现了从单脉冲到完整的50MHz，完全填补了锁模激光器和激光放大器系统之间通常存在的空白。对于神经科学家来说，这意味着可以使用所有可能的显微镜配置（从共振扫描到带螺旋扫描或时间聚焦的 SLM）优化光刺激。

全光纤架构的另一个优势是紧凑的尺寸，特别是与大容量/光纤混合方法相比。能够用在光刺激的激光器始终是相关配套设备的一部分，该设置还包括标准成像激光器和采用 SLM 的更复杂的两通道显微镜。因此，实验桌面的空间通常很紧张，而 Monaco 占用空间小，可优化实验桌面空间的使用。再者，相干公司持续开发新型激光器，致力于优化空间使用、自动化操作以及集成便利性，以满足日益复杂的大脑生理学实验的需求。例如，单波长激光器 Axon-920, 可用于 GCaMP 的 920 nm的成像，其小型化设计是 Monaco 的理想升级。

单波长激光器Axon 920

双光子光刺激可探测视觉感知

James Marshel 及其在 Karl Deisseroth 实验室（加利福尼亚州斯坦福大学）的同事最近在《科学》杂志上发表了一篇题为《皮质层特定的临界动力触发知觉》(Cortical layer–specific critical dynamics triggering perception) 的论文，其中证明了这种方法对多神经元光刺激的有效性和价值[1]。

在这篇论文中，他们研究了一些非常基本的视觉刺激如何在小鼠视觉皮层的特定方向的特定神经元集合中产生活性。他们展示了通过光遗传学方式激发这些神经元的关键子集，同样能促进功能相关神经元的广泛募集。这种募集并不需要特定方向的“Go/No-Go”任务（即小鼠移向水源），但这些任务会增强这种募集。

我们准备了表达光遗传学致动器的小鼠，光遗传学致动器是一种新发现的红移海洋视蛋白，我们将其命名为 ChRmine，它会引起内向（激发性）光电流。小鼠还体现了 GCaMP6m作为我们为钙离子成像选择的报告基因。 

至关重要的是，我们对离体神经元的测试表明，使用我们的成像参数，该致动器和报告基因之间没有明显的串扰。——James Marshel

ChRmine 是使用相干公司 Monaco 和专门设计的大像素 SLM 在 1035 nm 处通过双光子吸收激发的。他们确定，使用 210 µs 螺旋激发方案，能够以千赫兹的速度均匀地在主要视觉皮层 (V1) 中的第 2/3 表层的较大体积（1 平方毫米）上实现整体激发。

小鼠观察到漂移的正弦波光栅 [垂直方向 (0°) 或水平方向 (90°)，并且对比度有变化（2、12、25 或 50％）]，而 Ca2+ 信号被记录下来。在每只小鼠身上，识别了各个皮层中方向经过调整的集合 [39.9 ± 8.5（均值 ± SD）] 以响应这些移动的条纹刺激。然后，研究人员使用双光子光刺激了一组不同的已识别集合。 

Ca2+ 成像揭示了，在每种情况下，受刺激的神经元都在广泛的 V1 神经元网络中募集活性。通过双光子光刺激募集的神经元的动态模式与通过真实视觉刺激募集的模式相同。 

而且，实验表明，仅这种刺激就能够促使小鼠正确执行“Go/No-Go”任务，这是通过方向特定的（垂直或水平）训练学习的（为了学习和执行任务，我们采用头部固定配置对小鼠进行了研究，并使其在浮球上自由跑动）。

Marshel 总结了这项研究的背景：“通过这样的研究，我们正在最基本的细胞层面上慢慢阐明，如何在哺乳动物的大脑中激发并维持相应的视像。”